پس از دسته بندی، اختلاف در متابولیت های خونی، مواد معدنی و هورمون ها را می توان بین گروه ها ارزیابی کرد (به عنوان مثال گاوهای بیمار در برابر گاوهای سالم، گاوهای با عملکرد بالا در برابر گاوهای با عملکرد پایین، آبستن در برابر غیر آبستن، NEFA زیاد در برابر NEFA کم). روش معمول دیگر همبستگی متغیرهای خونی با متغیرهای سلامت و عملکرد است. با وجود عدم استفاده از آزمایش مداخله ای یا کنترل شده سنتی، تصور بر این است که افزایش NEFA، هایپرکتونومی و هایپو کلسمی رابطه سببی با موفقیت ضعیف گاو دوره انتقال دارد.

شکل 1 – مکانیسم های سنتی که به وسیله آن تصور می شود که هایپوکلسمی و افزایش اسیدهای چرب غیر استریفیه (NEFA) و هایپرکتونومی باعث مشکلات عملکرد و سلامت در گاو انتقالی می شود. (DA = جابه جایی شیردان، RA= جفت ماندگی)

در ادامه شواهدی ارائه می گردد که نشان می دهند، تغییر در NEFA، کتون ها و کلسیم در خون مسئول عواقب منفی در حیوان نیستند بلکه چنین مواردی بازتاب تغییرات متابولیکی طبیعی است که گاوهای سالم برای رسیدن به تولید بیشتر یا عواقب متابولیکی فعال ساختن سیستم ایمنی القا شده توسط کاهش مصرف خوراک ایجاد می شود.

همبستگی به معنای روابط علت و معلولی نیست

زمانی که ادعا می شود که ارتباط بین دو رویداد حتمی است و نه تصادفی، علیت و همبستگی با هم عوض می شوند. ده ها مقاله ارتباط بین متابولیت ها و مشکلات گاوهای انتقالی را نشان می دهند در حالیکه تناقضات بسیاری بین آنها وجود دارد. برای مثال، مقالات مختلف نشان می دهند که هیچ گونه ارتباطی بین NEFA، کتون ها و کلسیم و عواقب منفی وجود ندارد. ثبات یک اثر در زمان استنباطِ علّی تحقیقات مشاهده ای و میدانی بسیار مهم است. همان طور قبلاً اشاره شد، این اصول عمدتاً بر مبنای ارتباطات هستند و روابط علت و معلولی حاصل از آزمایش کنترل شده و مداخله گر نیستند. حتی از دیدگاه رابطه، ارزیابی قدرت یا استحکام ارتباطات به دلیل تنوع در تجزیه و تحلیل و روش های آماری دشوار است. به طور خاص، آستانه های متابولیت متفاوتی برای نتایج و نقاط زمانی (برای مثال قبل و بعد از زایش و هفته اول در برابر هفته دوم) در پژوهش های مشاهده ای تعیین شده است. علاوه بر این، ارتباط کمّی متناقض (به عنوان مثال، نسبت شانس، خطر نسبی، نسبت خطر) برای ارزیابی رابطه استفاده می شود. خلاصه ای از پژوهش های ارتباطی توسط McArt و همکاران (2013) و Overton و همکاران (2017) اخیرآ تدوین شده اند. اگر چه این گزارش ها نشان دهنده تعداد زیادی از پژوهش هایی می باشند که ارتباط متابولیت ها (NEFA، BHBA و Ca) را با سلامت و عملکرد نشان می دهند، آنها همچنین نشان دهنده تنوع قابل توجه در آستانه های متابولیت و قدرت ارتباط هستند. برای مثال همبستگی بین BHB و جا به جایی شیردان در پس از زایمان از 1/1 تا 6/27 در پژوهش ها متغیر بود (McArt و همکاران، 2013). جالب اینجاست که چند گزارش هم ارتباط منفی افزایش NEFA و کتون ها را با نتایج سلامت و همبستگی مثبت آن با عملکرد شیر نشان داده اند. روابط عکس شرح داده شده در بالا، محدودیت هایی را مثال می زند و مرز های دسته بندی سابق و اپیدمیولوژی را برجسته می کند. علاوه بر این، تأکید بر معیارهای کمّیِ ارتباط (به عنوان مثال نسبت شانس، ریسک های نسبی) می تواند منجر به عارضه ای غیر منتظره شود که با تفسیر انحرافی و اثر گذار از چگونگی تأثیر محصولات غذایی حاصل از دام ها بر سلامت انسان منجر شود.

سرکوب سیستم ایمنی فرآیندی پیچیده است

مسلماً بهترین شواهد در حمایت از موضوعات ادعا شده این است که نقش افزایش NEFA، هایپرکتونمی و هایپوکلسمی در سرکوب سیستم ایمنی و نقش آن در بروز بیماری از روی قرائن برآورد شود. به عنوان مثال انکوباسیون آزمایشگاهی نوتروفیل های خونی جدا سازی شده همراه با افزایش غلظت های NEFA و BHBA به طور منفی عملکرد لکوسیت ها را (نظیر انفجار اکسیداتیو نوتروفیل و ترشح آنتی بادی لنفوسیت) تحت تأثیر قرار داد. علاوه بر این فعالیت کموتاکسی و میلو پراکسیداز در نوتروفیل های جدا شده از گاوهای حول و حوش زایمان با NEFA و کتون های بالا مختل شد. القای هایپوکلسمی از طریق کلاتورهای کلسیم باعت کاهش فاگوسیتوز نوتروفیل در شرایط in vitro  و in vivo می شود (Martinez و همکاران، 2014). علاوه بر این لکوسیت های جدا شده از گاوهای هایپوکلسمیک، ذخایر کلسیم داخل سلولی را کاهش دادند  این تغییری است که در ارسال سیگنال کلسیم تداخل ایجاد کرده و مانع فعال شدن لکوسایت ها می شود (Lewis، 2001). در نتیجه فرض بر این است که پروفایل متابولیکی و مواد معدنی حاکم بر دوره حول و حوش زایمان بر عملکرد ایمنی تأثیر منفی بگذارد و با سرکوب سیستم ایمنی گاوها را مستعد ابتلا به انواع اختلالات و بیماری ها کند (شکل 1).  با این وجود تناقضاتی (in vitro و in vivo) در نحوه تأثیر این متابولیت ها و کلسیم در عملکرد لوکوسیت ها وجود دارد (LeBlanc، 2020). برای مثال Scalia و همکاران (2006) گزارش کردند که تولید گونه های واکنش پذیر اکسیژن (ROS) جمعیت نوتروفیل ها را کاهش می دهد اما زمانی که با افزایش غلظت NEFA در شرایط آزمایشگاهی انکوبه می شود، هیچ تغییری در فاگوسیتوز نوتروفیل ایجاد نمی کند.  به همین ترتیب، Ster و همکاران (2012) هیچ تفاوتی را در تکثیر سلول های تک هسته ای خون یا تولید اینترفرون گاما با غلظت های بیش از 1 میلی مول بر لیتر BHB مشاهده نکردند و از طرفی نیز هیچ تأثیری در انفجار اکسیداتیو تا 10 میلی مول بر لیتر مشاهده نشد. در مطالعه ای دیگر، هیچ ارتباطی بین غلظت های BHB و توانایی از بین رفتن نوتروفیل مشاهده نشد (Hammon و همکاران، 2006). حتی پژوهش ها روی جوندگان نشان داده اند که اجسام کتونی می توانند دارای اثر محافظتی بوده و آسیب ناشی از گونه های فعال اکسیژن را طی التهاب باکتریایی محدود کنند (Wang و همکاران، 2016). علاوه بر مغایرت های ذکر شده، بسط دادن نتایج آزمایشگاهی به کل بیولوژی جانوری دارای محدودیت های آشکاری می باشد و این موضوع در زمان بررسی سیستم ایمنی اهمیت می یابد.  به عنوان مثال بیشتر عملکردهای لکوسیت ها به طور یکپارچه به تغییر متابولیکی درون سلولی حاصل از فسفوریلاسیون اکسیداتیو گلیکولیز هوازی وابسته است و بسیار بعید است که شرایط آزمایشگاهی بتواند از غدد درون ریز خارج سلول و محیط انرژیتیک همراه با فعال سازی ایمنی نرمال تقلید کند. علاوه بر این تقریباً کل گاوهای شیری حول و حوش زایمان (حتی گاوهایی که به ظاهر سالم هستند) با درجاتی از فعال شدن ایمنی و التهاب روبرو هستند و محیط التهابی همراه آن اثر سرکوبگری بر عملکرد لوکوسیت ها دارد. این مورد به ویژه هنگام در نظر گرفتن نوتروفیل ها دارای اهمیت است زیرا آنها همچنان که در گردش خون هستند بالغ می شوند و این افزایش سن می تواند بر ویژگی های عملکردی آنها تأثیر بگذارد. حتی بیشتر نگرانی این است که التهاب باعث می شود که مغز استخوان نوتروفیل های نابالغ و ناقص را از جمله سلول های پروژنیتور نوتروفیل (Neutrophil progenitor cells) آزاد کند. بنابراین همگنی نوتروفیل های خونی در یک حیوان سالم به طور فزاینده ای در زمان فعال شدن سیستم ایمنی به صورت ناهمگن در می آید و این موضوع به احتمال زیاد بر عملکرد نوتروفیل موجود در داخل بدن تأثیر می گذارد. در نتیجه، مشخص نیست که آیا آزمایش های تعیین عملکرد برون تنی (ex vivo) در دوره انتقال، منعکس کننده سرکوب سیستم ایمنی است یا آیا واقعاً آسیب شناسی و رد پای لکوسیت ها با فعال سازی طبیعی سیستم ایمنی همراه است. به عبارت دیگر برخی از بخش ها ممکن است در سیستم ایمنی سرکوب شده به نظر برسند در حالی که دیگر بخش ها فعال هستند. پژوهش ها در مورد سیستم ایمنی بدن همواره نشان می دهند که اطلاعات ما در مورد اثرات متقابل پیچیده (به ویژه متابولیسم) بسیار کم و تفاسیر ما بیش از حد ساده انگارانه بوده است.

توازن منفی انرژی و کاهش وزن بدن در زمان شیردهی فرآیندی طبیعی است

فراخوان بافت چربی به منظور حمایت از شیردهی پاسخی کاملاً محافظت شده است. جالب اینجاست که در برخی از پستانداران مانند خرس، فُک، دلفین و نهنگ ها (به عنوان مثال نهنگ آبی) شیردهی همزمان با یک دوره طولانی مدت بدون خوردن غذا اتفاق می افتد، در نتیجه این پستانداران برای تأمین نیازهای انرژی خود، تقریباً به ذخایر بافت چربی متکی هستند. در حقیقت نهنگ ها 6 تا 7 ماه شیردهی را بدون خوردن غذا سپری می کنند و حدود 33 درصد از ذخایر چربی آنها فراخوان می شود که معادل 16 تن از وزن بدن است. در فُک ها، بیش از 90 درصد انرژی مورد نیاز برای شیردهی از طریق ذخایر چربی تأمین می شود و این پستانداران ممکن است بیش از 50 درصد از ذخایر چربی بدن خود را از دست بدهند. با توجه به اینکه بیشتر پستانداران دریایی قادر به انجام کتوژنز نیستند این فراخوان حتی چشمگیرتر نیز می باشد. از نظر تکاملی، حیوانات نزدیک به گاو، نظیر گوزن ها پس از زایمان دوره هایی از مصرف ناکافی را پشت سر می گذارند و برای حمایت از شیردهی حتی در زمان تغذیه آزاد نیز به ذخایر بدنی متکی هستند. صرف نظر همه این ها،  اتکای گونه ها به NEFA برای حمایت از شیردهی  نمونه هایی هستند که اهمیت این راهکار را بیشتر می کند. در حقیقت اینکه گاو تا چه اندازه چربی بدن را در اوایل شیردهی فراخوان کند در مقایسه با سایر گونه ها قابل دفاع است. در نتیجه، تفسیر کاهش وزن بدن و فراخوان بافت خارج از مرزهای مناسب زیست شناختی بوده و می تواند به یک قضاوت بدبینانه منجر شود.

NEFA و BHB مستقیماً مصرف مصرف خوراک را مهار نمی کنند

تنظیم مصرف خوراک موضوعی کاملاً پیچیده است و نمونه آن این است که مداخلات دارویی برای کاهش مصرف کالری در انسان تاکنون موفق آمیز نبوده است. نظریه هایی که سعی در بیان کنترل اشتهای نشخوارکنندگان دارند شامل احتیاجات انرژی، پر شدگی دستگاه گوارش و اکسیداسیون کبدی و تنظیم غدد درون ریز هستند. اثرات مخرب NEFA و هایپرکتونومی بر سلامت و عملکرد تا حدی به اثر سرکوب گرانه آنها در مصرف خوراک نسبت داده می شود. این دیدگاه عمدتاً در دامپزشک ها رایج است زیرا کلینیسین ها اغلب بنا به گفته دیگران ادعا می کنند که کتون ها باعت کاهش مصرف خوراک در گاوهای حول و حوش زایمان می شوند. با این حال این اثر ادعا شده، عمدتاً بر مبنای ارتباط است و در تضاد با بیولوژی نرمال همراه با یک دوره انتقال موفق (حتی با NEFA و BHB بالای خون) است. علاوه بر این چندین مطالعه تزریقی نشان می دهند که اشتها تا حد زیادی تحت تأثیر کتون ها و لیپیدها نیستند. در یک سری آزمایشات ظریف کنترل شده نشان داده شد که تزریق وریدی BHB بر روی خوراک تأثیری ندارد (Zarrin و همکاران، 2014) و تزریق پروپیونات و نه لیپید مصرف ماده خشک را در گاوهای اواسط شیردهی کاهش می دهد (Stocks و  Allen، 2014). هنگام بررسی منابع مختلف سوختی که به صورت مغزی تزریق شدند Davis و همکاران (1981) دریافتند که گلوکز و گلیسرول مصرف خوراک را کاهش می دهد در حالی که BHB تأثیری بر مصرف خوراک ندارد. علاوه بر این تزریق کتون به صورت وریدی مصرف خوراک را افزایش داد (Carneiro و همکاران، 2016). این آزمایش لازم است در چهار چوب هموستاتیک و هومورتیک تفسیر شود زیرا زمانی که حیوان در توازن مثبت انرژی است بکار گیری یک ماده به عنوان سوخت سلول، به طور غریزی مصرف انرژی را کاهش می دهد، و این مفهوم با آزمایش مداخله شده تقویت می شود.

صرف نظر از این، از نظر تکاملی فرضیه اینکه چرا NEFA و BHB اشتها را کاهش می دهند از نظر بیو انرژیتیک دارای اشکال است. فراخوان بافت چربی و تبدیل بخشی از آن به کتون، یک راهکار متابولیکی کلیدی بدن است که دام ها برای حفظ عضلات اسکلتی و نهایتاً زنده ماندن در شرایط توازن منفی انرژی از آن استفاده می کنند. اهمیت کتوژنز در زمان های سوء تغذیه از آن جهت دارای اهمیت است که جهش در ژن تنظیم کننده ساخت کتون (HMG-COA سنتتاز میتوکندریایی) منجر به کمای ناشی از افت قند خون در عرض چند روز می شود.  اتکاء به لیپید ذخیره شده در طی کمبود انرژی به قدری حساب شده است که حتی میکروارگانیسم ها توانایی ذخیره و اکسیداسیون NEFA و تبدیل انرژی اسید چرب به کتون را دارند. بنابراین حتی ساده ترین اشکال زندگی نیز از زمان شروع حیات از سوخت های کهن ساده (NEFA و کتون) استفاده می کرده اند. اگر NEFA و کتون ها تمایل به خوردن غذا را کم کنند، یک حیوان گرسنه بی اشتها خواهد ماند، سناریویی که باعث نابودی آنها می شود. به طور خلاصه، سالهاست که حیوانات به سمت توازن منفی انرژی رفته اند (به عنوان مثال، عدم امنیت غذایی، خواب زمستانی، مهاجرت و شیردهی) و اکسیداسیون NEFA و کتون ها برای زنده ماندن کاملاً ضروری است.

گاوهایی که تولید بالایی دارند دچار هایپوانسولینمیک[1] (Hypoinsulinemic) هستند

یک استراتژی کلیدی (شاید مهم ترین بخش) برای موفقیت در تولید شیر (Lactogenesis) و حفظ تداوم تولید شیر (Galactopoiesis)، توسعه مقاومت به انسولین هم در ماهیچه اسکلتی و هم در بافت چربی و کاهش ترشح انسولین از پانکراس می باشد. همانطور که پیش تر گفته شد، این موضوع اجازه می دهد تا فراخوان بافت چربی و NEFA موجود در اکثر انواع سلول ها و بافت ها به عنوان راهی برای ذخیره گلوکز برای ساخت شیر باشد. بنابراین جای تعجب نیست که (1) گاوهایی که شیر بیشتر تولید می کنند نسبت به گاوهایی با تولید کمتر در کل دوره شیردهی هایپوانسولینمیک تر می باشند (2) غلظت انسولین در گاوهای حول و حوش زایمان به طور معکوسی با کل عملکرد شیردهی مرتبط است. (3) کلیرانس انسولین (حذف از گردش خون) با انتخاب ژنتیکی برای تولید شیر افزایش می یابد و (4) استفاده از انسولین یا عوامل حساس کننده به انسولین تولید شیر را کاهش می دهد.

اگرچه روی انسولین فی نفسه تمرکز نمی شود، اما ارزیابی اینکه چگونه تغذیه جیره های غذایی با انرژی کنترل شده (سطح انرژی پایین) قبل از زایمان متابولیسم انرژی و تولید را تحت تأثیر قرار می دهد یک قالب مفهومی بیشتری را در اهمیت انعطاف پذیری متابولیک برای شیردهی نرمال فراهم می کند. جیره های کم انرژی قبل از زایمان به طور مطلوبی NEFA، کتون ها و محتوای چربی کبد را پس از زایمان کاهش دادند، اما این تعجب آور نبود که با کاهش قابل توجه در عملکرد تولید (ECM و FCM) همراه بود. علاوه بر این، صرف نظر از جیره غذایی، گاوهایی که بعد از زایمان کتون های خون را افزایش داده بودند (2/1 تا 9/2 میلی مول در لیتر) نسبت به گاوهایی که غلظت کتون در وضعیت سلامت در نظر گرفته شدند (کمتر از 2/1 میلی مول بر لیتر)، شیر بیشتری تولید کردند ( Rathbun و همکاران، 2017). واضح است که فراخوان بافت چربی و تبدیل NEFA به کتون یک سازگاری فیزیولوژیکی است که پستانداران از آن برای اولویت بندی ساخت شیر استفاده می کنند و به نظر می رسد که تلاشی در جهت دخالت دادن با این فرآیند همورتیک در هزینه تولید شیر باشد.

وضعیت گیج کننده انسولین در بیماری کتوز

با توجه به نقش تنظیمی انسولین به عنوان تنظیم کننده قوی متابولیسم، تولید قابل توجه شیر همراه با کتوز ناشی از فراخوان بیش از حد چربی باید با هایپوانسولینمی همراه باشد. بر این اساس بیشتر گاوهای هایپرکتونمیک حول و حوش زایمان به طور هم زمان هایپوانسولینمیک هستند و گفته شده که هایپوانسولینمی پیش شرط توسعه کتوز است (Hove، 1974). با این حال، گاهی هیچ تفاوتی در انسولین خون بین گاوهای کتوتیک و سالم وجود ندارد (Oikawa و همکاران، 2019) و در حقیقت، کتوز گاهی اوقات با هایپرانسولینمی نیز همراه است. علاوه بر این، تصور می شود که هایپرانسولینمی پیش از علائم بالینی کتوز بروز می کند. این وضعیت یک پروفایل اندوکرینی پاتولوژیک خاص است و انسولین به طور معمول از وقوع کتوز در چندین سطح جلوگیری می کند : (1) کند کردن فراخوان بافت چربی (2) کاهش گلوکونئوژنز کبدی و در نتیجه به حداقل رسیدن تخلیه موجودی اگزالواستات چرخه TCA (3) کاهش انتقال اسید چرب به میتوکندری از طریق کاهش فعالیت کارنیتین پالمیتوئیل ترانسفراز 1(CPT1) (4) محدود کردن آنزیم ساخت کتون (HMG-COA سنتتاز) (5) افزایش به کار گیری کتون توسط بافت های محیطی. ضمناً، علی رغم بی اشتهایی، فعال سازی ایمنی نیز با هایپرانسولینمی حاد همراه است. در نتیجه، عوامل متعدد متابولیکی و اندوکرینی وجود دارند که به وضوح با کتوز مرتبط اند.

موفقیت های متناقض در درمان کتوز

با توجه به نقش حیاتی هایپرکتونمی در پاتوفیزیولوژی گاو دوره انتقال، این عقیده وجود دارد که مداخله بالینی بهره وری را افزایش می دهد. در حقیقت، استفاده از پروپیلن گلایکول به گاوهای هایپرکتونِمیک تحت بالینی باعث افزایش تولید شیر می شود، اما در بعضی پژوهش ها اینگونه نبود. دلیل این تناقض ها مشخص نیست. با این حال،  توضیح برای اثر مثبت استفاده از پروپیلن گلایکول ممکن است این باشد که گلوکز درون زادی اضافی تولید شده به طور موقت بار نیاز به گلوکز را در گاوهای دوره انتقال که همزمان دچار التهاب نیز هستند را کم می کند. دلیل مشاهده نکردن اثر پروپیلن گلایکول روی تولید شیر در گاوهای سالم و درگیر هایپرکتونومی این بود که آنها دارای یک مکانیسم تنظیمی اساسی بودند که آنها برای اولویت بندی ساخت شیر استفاده می کردند. علاوه بر این،  کتون ها فراخوان بافت چربی را کند می کنند، بنابراین کاهش کتون ها از نظر درمانی حین بیماری کتوز تحت بالینی می تواند ضرر بیشتری داشته باشد تا فایده بیشتر. صرف نظر از این، شواهد این نظریه را که درمان دارویی هایپرکتونومی به سود ساخت شیر است حمایت نمی کنند. اتفاقاً، استفاده از استروئیدها به عنوان بخشی از پرهیز غذایی برای بهبود کتوز، با توجه به نقش آن در سرکوب سیستم ایمنی، نیاز به بررسی مجدد و کلی دارد.

به طور خلاصه، مشکلات سلامت در گاو های دوره انتقال، تولید شیر کمتر از سطح بهینه، حذف پیش از بلوغ و عملکرد تولید مثلی ضعیف موانع کلیدی در سوددهی گله های گاو شیری محسوب می شوند. در طول 50 سال گذشته، دانشمندان به طور فزاینده ای بالابودن NEFA، کتون ها و هایپوکلسمی در خون را به عنوان پیامد منفی و پاتولوژی مشاهده نموده اند. این اصل اغلب بر اساس پژوهش های مشاهده ای، اپیدمیولوژی، همبستگی ها و سنجه های عملکردی سلول های ایمنی در خارج بدن می باشد. با این حال، آنچه مسلم است اینکه بیماری ها و اختلالات حول و حوش زایمان را نمی توان با شدت تغییرات در این متابولیت ها تشریح نمود. تفسیر بیومارکرها به عنوان عوامل ایجاد کننده اختلالات متابولیکی، هدف از پژوهش های اپیدمیولوژیک را به انحراف می کشاند. ما بر این باوریم که تغییرات پس از زایمان در متابولیسم انرژی و کلسیم منعکس کننده فرآیندهای بیولوژیکی طبیعی است که گاوهای سالم از آن برای به حداکثر رساندن ساخت شیر یا کم کردن شدت اختلالات در این فرآیندها ناشی از تغییرات التهاب  و اولویت بندی سلامت استفاده می کنند  (Horst و همکاران، 2021).

شکل 2 – پیامدهای بالقوه فعال سازی سیستم ایمنی. در این مدل، کاهش مصرف خوراک، هایپوکلسمی، NEFA بیش از حد، هایپرکتونومی، و لیپیدوز کبدی عامل عملکرد و سلامت ضعیف گاوهای انتقالی نیستند بلکه تحریک ایمنی اولیه را منعکس می کنند.

1- هایپوانسولینمی: شرایطی است که در آن مقدار انسولین موجود در خون کمتر از مقدار طبیعی و متناسب قند خون می‌شود.