مقدمه

حدود70 درصد از دفع فسفر (P) در حیوانات مزرعه‌ای مربوط به پرورش نشخوارکنندگان است (تامینگا و ورشتگن، 1992). در گاوداری های شیری، دفع فسفر به طور عمده ناشی از فسفر هضم‌نشده در مدفوع است. دفع از طریق مدفوع (کود) سبب شده تا فسفر یا از طریق دفع مستقیم (در سیستم‌های مبتنی بر مرتع)، یا از طریق استفاده در زمین‌های زراعی یا علفزارهای مجاور (در سیستم‌های دامداری مستقر) مستقیماً به خاک برگردد. در صورتی که اقدامات با دقت نظارت و کنترل نشوند، هر دو روش ممکن است منجر به تجمع فسفر در خاک شوند. فسفر اضافی در محیط تأثیر منفی قابل توجهی بر اکوسیستم‌های آبی می‌گذارد و متعاقباً خطراتی را برای سلامت انسان و اقتصاد به همراه دارد (شارپلی و همکاران، 1994؛ ویترز و همکاران، 2015). در برخی از کشورها، مانند هلند، بر استفاده از کود به عنوان بخشی از تلاش برای کاهش تجمع فسفر در محیط به‌شدت تأکید شده است. در سایر مناطق جهان نیز کاهش دفع فسفر در گاوداری های شیری راه‌کار اصلی برای به حداقل رساندن اثرات منفی فسفر اضافی بر محیط است. بهینه‌سازی محتوای فسفر جیرۀ غذایی به‌گونه‌ای که فسفر تا حد ممکن در سطوح مورد نیاز تغذیه شود و بهبود بازدهی استفاده از فسفر موجود در خوراک، راهکارهای اصلی برای کاهش دفع فسفر هستند (والک و همکاران، 2000). با کمک این راهکارها، در صورتی که از فسفر جیرۀ غذایی به طور کامل استفاده شود، می‌توان هزینه‌های خوراک را با کاهش نیاز به افزودن فسفات معدنی پرهزینه از سنگ فسفات (که منبعی محدود است) کاهش داد. این امر همچنین به تولید پایدارتر محصولات کشاورزی کمک می‌کند و در عین حال، انعطاف‌پذیری بیشتری را در انتخاب مواد حاوی فسفر ایجاد می‌کند.

در ترکیبات خوراکی گیاهی، فسفر به طور عمده به شکل فیتات (نمک اسید فیتیک (میو-اینوزیتول هگزا فسفات، IP₆) وجود دارد. فیتات باید تجزیه شود تا فسفات معدنی (Pi) آزاد شود که می‌توان از آن به طور مستقیم برای رشد و نگهداری حیوان استفاده کرد. پژوهش‌های زیادی نشان داده است در حیوانات تک‌معده‌ای که فعالیت آنزیم فیتاز و فسفاتاز درون‌زا در آن‌ها کم است. فیتات به دلیل توانایی آن در اتصال با مواد معدنی، پروتئین‌ها و اسیدهای آمینه در برخی قسمت های دستگاه گوارش، موجب کاهش دسترسی و قابلیت هضم این مواد مغذی و افت عملکرد رشد می گردد و از اینرو به عنوان یک مادۀ ضد مغذی قوی در نظر گرفته می­شود (سل و راویندران، 2007؛ سل و همکاران، 2012؛ هومر و همکاران، 2015). در نتیجه، جیرۀ حیوانات تک‌معده‌ای به طور معمول با فیتاز میکروبی اگزوژن مکمل سازی می‌شود تا قابلیت دسترسی و استفاده از فسفر موجود در خوراک بهبود یابد و اثر ضد تغذیه‌ای فیتات کاهش یابد. به طور سنتی، اعتقاد بر این است که استفاده از مکمل فیتاز در خوراک گاوهای شیرده منافعی در پی ندارد. علت این موضوع، فعالیت بالای فیتاز باکتریایی شکمبه است که فیتات را هیدرولیز می‌کند و فسفر معدنی را برای جذب در روده کوچک آزاد می‌کند (راون و همکاران، 1956؛ یانک و همکاران، 1998؛ گایتون و همکاران، 2003). مورس و همکاران (1992) در مطالعه‌ای مهم گزارش کردند ناپدید شدن فسفر فیتاته (PP) در طیف وسیعی از کنسانتره‌های غلات و دانه‌های روغنی انکوبه‌شده با مایع شکمبه در شرایط آزمایشگاهی بیش از 99 درصد بود، و قابلیت هضم ظاهری PP در کل دستگاه گوارش گاوهای شیرده بین 94 تا 99 درصد گزارش شد. به همین ترتیب، کلارک و همکاران (1986) قابلیت هضم ظاهری PP در گاوهای شیرده پرتولید را بیش از 95 درصد گزارش کردند. با وجود این، مطالعات جدیدتر قابلیت هضم ظاهری PP در کل دستگاه گوارش را کمتر و با تغییرپذیری بین 69 تا 97 درصد گزارش کردند (کینکید و همکاران 2005؛ براسک-پدرسن و همکاران 2013؛ جارت و همکاران 2014). در عمل، تجزیه‌پذیری فیتات در شکمبه ممکن است تحت تأثیر عوامل مختلف، متفاوت باشد. این عوامل عبارت‌اند از: ترکیب جیرۀ غذایی، نسبت علوفه به کنسانتره، که ممکن است فلور میکروبی شکمبه و در نتیجه ظرفیت آن برای هضم فیتات را تغییر دهد (یانکه و همکاران، 1998؛ هومر و زبلی، 2015)، قابلیت دسترسی فسفر مواد خوراکی به طور جداگانه (هیز و همکاران، 2020)، که ممکن است تحت تأثیر روش فرآوری بکار رفته برای محافظت از پروتئین‌ها در شکمبه متفاوت باشد (براوو و همکاران، 2000)، سرعت عبور مواد هضمی از شکمبه که در گاوهای پرتولید امروزی که با کربوهیدرات‌های سهل التخمیر تغذیه می‌شوند بیشتر است و باقی ماندن PP به صورت تجزیه نشده در شکمبه شود (کرمر و همکاران، 2013؛ هومر و زبلی، 2015). علاوه بر این، pH خنثی شکمبه که معمولاً بین 6 تا 7 است (وینتر و همکاران، 2015؛ کیم و همکاران، 2018) ممکن است برای میکروب‌های شکمبه که تولیدکنندۀ سیستئین فیتاز هستند بهینه نیست چون pH  مطلوب این دسته از فیتازها 5/4 است (یانکه و همکاران، 1998؛ پولل و همکاران، 2008).

فیتازهای میکروبی اگزوژن، عمدتاً با منشاء باکتریایی، به طور گسترده به عنوان افزودنی‌های خوراکی در جیره‌های تجاری طیور و خوک‌ برای بهبود قابلیت هضم فسفر از طریق هیدرولیز فیتات استفاده می‌شوند (سل و راویندران، 2007؛ هومر و همکاران، 2015). اثرات مفید فیتاز اگزوژن بر هضم و مصرف سایر مواد مغذی از جمله پروتئین، اسیدهای آمینه (AA)، انرژی و نشاسته همچنین در حیوانات تک‌معده‌ای به ویژه در طیور مشهود است (سل و همکاران، 2000؛ راویندران و همکاران، 2006؛ ترونگ و همکاران، 2014، 2015). کارهای علمی مربوط به اثرات فیتاز اگزوژن بر قابلیت هضم مواد مغذی در گاوهای شیرده محدودتر است. با این وجود، برخی مطالعات پتانسیل فیتاز را برای بهبود قابلیت هضم PP ارزیابی کرده‌است (کینکید و همکاران، 2005؛ براسک-پدرسن و همکاران، 2013؛ وینتر و همکاران، 2015؛ جیگنونی و همکاران، 2021).

به‌تازگی، یک 6-فیتاز باکتریایی بیوسنتزی که برای عملکرد در حیوانات تک‌معده‌ای بهینه شده است توسعه یافته است و خصوصیات آن همراه با یکی از انواع بیوسنتزی آن منتشر شده است (کریستنسن و همکاران، 2020). مطالعۀ حاضر به دنبال بررسی امکان استفاده از این 6-فیتاز باکتریایی در جیرۀ غذایی گاوهای شیرده، بدون افزودن فسفات معدنی، بر قابلیت هضم P، PP و CP انجام گرفت. فرض آزمایش این بود که افزودن فیتاز به جیرۀ گاوهای شیری، قابلیت هضم ظاهری P، PP و CP را در کل دستگاه گوارش بهبود می‌بخشد.

مواد و روش‌ها

این مطالعه مطابق دستورالعمل 63/2010 اتحادیۀ اروپا و مقررات هلند برای مراقبت و استفاده از حیوانات در پژوهش‌ها انجام شد. تمام پروتکل‌ها و رویه‌های آزمایشی توسط مرجع مرکزی رویه‌های علمی در رابطه با حیوانات (کمیسیون مرکزی دیرپروون، دن هاگ، هلند) و کمیتۀ اخلاقی آزمایش‌های حیوانی (آزمون‌های اخلاقی  دیرپروون) گروه پژوهش‌ تغذیۀ شوتورست (للیستاد، هلند) ارزیابی و تأیید شدند (کد تأیید AVD246000202010084 ). آزمایش در ماه های آوریل و می 2021 انجام گرفت.

حیوانات، جیره های آزمایشی و تغذیه

این آزمایش با 30 گاو شیرده هلشتاین-فریزن در مزرعۀ آزمایشی گروه پژوهش‌ تغذیۀ شوتورست (للیستاد، هلند) انجام شد. از گاوها چند شکم زایش استفاده شد. در شروع آزمایش، به طور میانگین، تولید شیر روزانه 34 کیلوگرم، تعداد روزهای شیردهی 158 روز، وزن بدن گاوها 690 کیلوگرم، و دوره شیردهی 3/3 بود. گاوها در گروه های انفرادی در یک اصطبل بسته با آبشخور آزاد نگهداری می‌شدند. اصطبل مجهز به اطاقک‌هایی (1.10 × 2.5 متر) بود که کف آن‌ها از جنس لاستیک بود و کاه خردشده کف آن‌ها ریخته شده بود. در این اطاقک‌ها دسترسی به آب آزاد بود. وضعیت سلامتی گاوها روزانه کنترل می‌شد و هرگونه علائم بیماری بالینی ثبت می‌شد و تیمار مناسب و به‌موقع برای آن‌ها انجام می‌شد.

جیره‌های تیمارداری از گاوها شامل یک جیرۀ کنترل (CON) فرموله‌شده بدون مکمل Pi و دو جیرۀ آزمایشی مبتنی بر جیرۀ کنترل به اضافۀ مکمل فیتاز تجاری در سطح 2000 یا 5000 واحد فیتاز (FTU) به ازای هر کیلوگرم ماده خشک خوراک بود. فیتاز مکمل یک 6-فیتاز باکتریایی بیوسنتزی، PhyG بود (تغذیه و سلامت حیوانات دانمارکی، IFF، هلند) که در باکتری تریکودرمی ریسی[1] بیان شده بود.

علوفه و کنسانتره به طور جداگانه به گاوها داده شد. نسبت علوفه به کنسانتره فرموله‌شده حدود 65%:35% بود. گاوها از طریق دروازه‌هایی (کالان آمریکایی، نورث وود، نیوهمشایر) به آبشخورهای جداگانه دسترسی داشتند و ظرف‌های کنسانتره جداگانه در این آبشخورها قرار داده شده بود. بدین ترتیب میزان مصرف علوفه توسط گاوها اندازه‌گیری می‌شد. علوفه شامل مخلوطی از نسبت ثابت علوفۀ سیلوشده به ذرت سیلوشده (30:70 بر مبنای ماده خشک) بود و به صورت آزاد در اختیار گاوها قرار می‌گرفت. ترکیب شیمیایی علوفه‌ها در جدول 1 نشان داده شده است. علوفه به صورت مخلوط و دو بار در روز (تقریباً در 0700 و 1400 ساعت) از طریق سیستم توزیع‌کننده خورکار (ربات معلق تغذیه کننده Triomatic HP 2 300) مجهز به انبار تغذیه Triomatic T40 در اختیار دام ها قرار می گرفت (فناوری تغذیۀ تریولت، اولدنزاال، هلند). با این کار، امتناع از تغذیه برطرف شد و میزان تغذیۀ مصرفی روزانه ثبت می­شد. کنسانتره‌ توسط شرکت دیروودینگ (لئوسدن، هلند) تولید و پلت شده بود. کنسانتره‌ به صورت جداگانه در ظرف کنسانتره هر گاو، بر اساس نوع تیمار، سه بار در روز (5 صبح، 5/12 و 5/6 بعداز ظهر) از طریق دستگاه توزیع کنسانترۀ خودکار (هوتراخوس، هگلسوم، هلند) در مقادیری که برای هر گاو بر اساس تولید شیر تصحیح ‌شده بر اساس چربی و پروتئین (FPCM) تعیین می­گردید، عرضه می‌شد. هدف از انجام این کار محاسبۀ دقیق‌تر نیازهای غذایی هر گاو بود. مقدار کنسانترۀ ارایه‌شده در طول دورۀ آزمایش تغییر داده نشد، زیرا ممکن بود این کار بر تولید شیر یا DMI تأثیر بگذارد و توانایی تشخیص اثرات تیمار بر این اقدامات پاسخ را کاهش دهد. قبل از تولید کنسانتره، از مواد تشکیل‌دهنده برای آنالیز محتوای PP و P کل نمونه‌برداری شد. پس از آن، کنسانتره بهینه‌سازی شد تا حاوی حداقل 2.3 گرم بر کیلوگرم PP و حداکثر 3.1 گرم بر کیلوگرم P کل باشد (معادل 2.8 گرم بر کیلوگرم DM بر اساس جیرۀ کل). کنسانتره‌ها به گونه‌ای فرموله شدند که حاوی مواد غنی از فیتات با تجزیه‌پذیری کم شکمبه، مانند کنجاله کلزا تیمارشده با فرمالدئید و کنجاله دانۀ آفتابگردان تیمارشده با فشار هیدروترمال باشند. به منظور تخمین دفع مدفوع، نشانگر خارجی دی اکسید تیتانیوم (TiO₂) در سطح 7 گرم بر کیلوگرم (همان‌طور که هست) به کنسانتره‌ها اضافه شد. مواد تشکیل‌دهنده و ترکیب شیمیایی کنسانتره‌ها در جدول 2 آورده شده است، در حالی که ترکیب شیمیایی محاسبه‌شده کل جیره در جدول 3 ارائه شده است.

جدول 1. ترکیب شیمیایی علوفه

nd، تعیین نشده است.

[1] Trichoderma reesei 

کل جیره‌ها به منظور برآورده کردن نیازهای مواد مغذی مطابق توصیۀ سیستم هلندی (CVB، 2018) فرموله شدند، به جز فسفر که در سطح 2.8 گرم بر کیلوگرم DM در جیرۀ کل فرموله شد و هدف از آن تأمین 90 درصد نیاز فسفر توصیه‌شده COMV (2005) بود.

طرح آزمایشی

این آزمایش در قالب طرح بلوک‌ تصادفی با سه تیمار غذایی و 10 بلوک (تکرار) انجام شد. این آزمایش شامل یک پیش‌دورۀ 18روزه برای جمع‌آوری داده‌ها بود که بر اساس آن گاوها به سه گروه تیمار تقسیم‌بندی شدند، به دنبال آن یک دورۀ آزمایشی 19روزه شامل یک مرحلۀ انطباق با رژیم غذایی 14روزه، که برای آزمایش‌های قابلیت هضم توصیه می‌شود (GFI، 1991) و یک مرحلۀ 5 روزه برای جمع‌آوری مدفوع سپری شد. در طول ‌پیش دوره، همۀ گاوها به طور آزاد با مخلوطی از علف سیلوشده و ذرت سیلوشده به همان نسبت‌هایی که در بالا بیان شد، تغذیه شدند و با کنسانتره‌ (به همان صورتی که در بالا توضیح داده شد، اما بدون فیتاز مکمل) بر اساس تولید شیر غنی‌شده با چربی و پروتئین مکمل شدند. گاوها بر اساس تعداد گوساله در هر زایش، مقدار مصرف ماده خشک و تولید شیر تصحیح شده به بلوک‌ها اختصاص داده شدند و در داخل هر بلوک، گاوها به طور تصادفی توزیع شدند.

نمونه‌برداری، اندازه‌گیری و تجزیه و تحلیل شیمیایی شیر

گاوها دو بار در روز (4 صبح و 5/3 بعداز ظهر) توسط یک شیردوش 12 تایی دو طرفه دوشش شدند. میزان تولید شیر به صورت جداگانه در هر دوشش با استفاده از شیرسنج‌های الکترونیکی کالیبره‌شده (DemaTron 70، GEA، دوسلدورف، آلمان) ثبت می‌شد. نمونه‌های شیر هر هفته از هر گاو در عصر دوشنبه، صبح سه‌شنبه، عصر چهارشنبه و صبح پنجشنبه تا پایان دورۀ آزمایش (روز 19) جمع‌آوری شد. نمونه‌های شیر با محلولی حاوی آزید سدیم و برونپول (0.3 میلی‌لیتر محلول اضافه‌شده در هر 50 میلی‌لیتر شیر) نگهداری شدند و محتوای چربی، پروتئین، لاکتوز، اوره و تعداد سلول‌های سوماتیک نمونه ها توسط یک طیف‌سنجی مادون قرمز (میلکواسکن FT6000/7، فاس الکتریک، هیلرود، دانمارک) سنجش شد. دو نمونه شیر اضافی (50 میلی‌لیتر) از هر گاو (صبح و عصر) در هفتۀ آخر آزمایش گرفته شد، به نسبت 1:1 (v:v) ترکیب شد و برای محتوای P مطابق روش طیف‌سنجی ISO6491 (ISO، 1998) تجزیه و تحلیل شد.

جدول 2. مواد تشکیل‌دهنده، ترکیب شیمیایی تجزیه‌وتحلیل‌شده، و فعالیت فیتاز کنسانتره‌ها

¹CON، کنترل؛ 2000 PhyG، حاوی PhyG فیتاز در 2000 MD FTU/kg، 5000 PhyG  حاوی فیتاز PhyG در 5000 FTU/kg DM.

² ترکیب شیمیایی بر اساس تولیدکننده در گرم بر کیلوگرم: 132 کلسیم، 1 فسفر، 140 میلی‌گرم، 75 سدیم، 116 کلر، 3 پتاسیم، 0.9 گوگرد، 400 میلی‌گرم مس، 600 میلی‌گرم روی، 1600 میلی‌گرم منگنز، 25 میلی‌گرم کبالت، 110 میلی‌گرم ید، 30 میلی‌گرم سلنیم، 750000 واحد بین‌المللی ویتامین A، 200000 واحد بین‌المللی ویتامین D3، 1500 واحد بین‌المللی ویتامین E.

تغذیه

مقدار خوراک پایه (علوفه) و کنسانتره اختصاص یافته و نیز خوراک باقیمانده به صورت جداگانه توزین شد و به صورت روزانه (علوفه) یا هفتگی (کنسانتره) ثبت شد. مصرف خوراک روزانه از طریق اختلاف بین مقدار اختصاص یافته و باقیمانده محاسبه شد. نمونه‌های علوفه که به صورت هفتگی جمع‌آوری شد، مخلوط و برای تجزیه و تحلیل شیمیایی به روش طیف‌سنجی مادون قرمز نزدیک (NIRS) به آزمایشگاه معتبر یوروفینز آگرو NL (واگنینگن، هلند) فرستاده شد. کنسانتره‌ها در یک دسته تولید و بلافاصله نمونه‌برداری و تحلیل شدند. از ترکیب شیمیایی نمونه‌های علوفه‌ و کنسانتره برای محاسبۀ ترکیب شیمیایی جیرۀ کل استفاده شد. در هفتۀ آخر آزمایش و 2 روز قبل از شروع نمونه‌برداری مدفوع، نمونه‌های اضافی علوفه‌ها و کنسانتره‌ها برای تعیین قابلیت هضم ظاهری کل مجاری هاضمه ترکیبات شیمیایی جمع‌آوری شدند. علوفه‌ها به صورت روزانه و کنسانتره‌ها هر 2 روز یک بار نمونه‌برداری شدند. نمونه‌ها در دمای 20- درجۀ سانتی‌گراد تا تجزیه و تحلیل بعدی نگهداری شدند. در پایان آزمایش، علوفه‌ها در دمای اتاق ذوب شدند، هر نمونۀ علوفه با مخلوط کردن مقادیر مساوی بر اساس FM جمع‌آوری شد، سپس به مدت تقریبی 96 ساعت در دستگاه سابلیماتور زیربوس 3-4-5/20 (فناوری زیربوس بنلوکس B. V.، تیل، هلند) منجمد و خشک شد و با استفاده از آسیاب Retsch  ZM200 (رچ بنلوکس، آرتسلار، بلژیک) پودر شد و توسط یک الک 1 میلی‌متری غربال شد.

نمونه‌های علوفه و کنسانتره توسط گروه پژوهش‌ تغذیۀ شوتورست (للیستاد، هلند) تحلیل شدند. مقدار DM با خشک کردن در دمای 103 درجۀ سانتی‌گراد تا وزن ثابت طبق روش ISO 6496 (ISO، 1998) تعیین شد. خاکستر خام پس از خاکستر شدن نمونه‌ها در کورۀ موفل به مدت 3 ساعت در دمای 550 درجۀ سانتی‌گراد طبق روش ISO 5984 (ISO، 2002) به روش وزن‌سنجی به دست آمد. محتوای N با روش دوما با استفاده از تعیین‌کنندۀ کلان (LECO CM928 MLC، LECO، میشیگان، ایالات متحدۀ آمریکا) طبق روش ISO 16634 (ISO، 2016) تعیین شد و محتوای CP به صورت N × 6.25 محاسبه شد. محتوای نشاسته (به جز در علف سیلوشده) با روش آمیلو گلوکوزیداز مطابق روش انگلیست و همکاران (1992) تعیین شد و محتوای قند با استفاده از روش لوف-اسکورل به دست آمد. چربی خام با استخراج اتر پس از هیدرولیز اسیدی، طبق روش ISO 11085 (ISO، 2015) تعیین شد. محتوای NDF از خاکستر باقیمانده و طبق ISO 16472 (ISO، 2006) با افزودن یک α-آمیلاز پایدار در برابر حرارت تعیین شد. محتوای ADF منحصر به خاکستر بود و بر اساس ISO 13906 (ISO، 2008) به دست آمد. مقدار P بر اساس روش رنگ‌سنجی مطابق با ISO 6491  (ISO، 1998) و محتوای Ca و TiO₂ بر اساس طیف‌سنجی جذب اتمی بر اساسISO 6869  (ISO، 2000) تعیین شد. محتوای PP در علوفه و کنسانتره در مرکز پژوهش تغذیۀ دام دانیسکو (بربراند، دانمارک) با استفاده از روش HPLC که توسط کریستنسن و همکارانش (2020) توصیف شده است و در واقع اصلاح‌شدۀ روش ارائه‌شده توسط اسکوگلند و همکاران (1998) است، تجزیه و تحلیل شد. اصلاح روش تحلیلی به این صورت بود که استخراج IP₆ از نمونۀ مدفوع در غلظت 0.20 گرم در میلی‌لیتر با استفاده از 1.0M HCl به عنوان حلال انجام شد. فعالیت فیتاز در نمونه‌های کنسانتره توسط مرکز پژوهش تغذیۀ حیوانات دانیسکو (برابرند، دانمارک) بر اساس نسخۀ اصلاح‌شده روش AOAC 2000.12  تحلیل شد (انگلن و همکاران، 2001). در این روش، FTU به عنوان مقدار آنزیمی تعریف شد که 1 میکرومول ارتو فسفات معدنی را از یک بستر فیتات سدیم 0.0051 مول در لیتر در دقیقه در pH  5.5 در دمای 37 درجۀ سانتی‌گراد آزاد می‌کند.

جدول 3. ترکیب شیمیایی¹، مقادیر تغذیه و فعالیت فیتاز کل تیمارهای تغذیه‌ای

¹محاسبه‌شده از مقادیر تجزیه و تحلیل ارائه‌شده در جداول 1 و 2، محاسبۀ مصرف تغذیه

²CON، کنترل؛ 2000PhyG ، حاوی فیتاز PhyG در جیرۀ 2000FTU/kg  DM ، 5000PhyG  حاوی فیتاز PhyG در جیرۀ 5000 FTU/kg DM.

³ ارزش تغذیۀ جیره‌ها که بر اساس سیستم ارزیابی هلندی تخمین زده شده است (CVB، 2018)، که در آن VEM انرژی خالص برای شیردهی است و DVE پروتئین قابل سوخت و ساز است.

مدفوع

نمونه‌های مدفوع (حدود 500 گرم) از همۀ حیوانات دو بار در روز در طول 5 روز آخر آزمایش جمع‌آوری شد. نمونه‌برداری مدفوع در ساعت 9 صبح و 1 بعدازظهر در روزهای 1، 3 و 5 و در ساعت 11 صبح و 5/2 بعدازظهر در روزهای 2 و 4 انجام شد. این الگوی نمونه‌برداری به منظور محاسبۀ تغییرات روزانه در دفع نشانگر به کار گرفته شد (گلیندمن و همکاران، 2009). نمونه‌ها بلافاصله پس از جمع‌آوری در دمای 20- درجۀ سانتی‌گراد منجمد شدند و تا تجزیه و تحلیل بعدی نگهداری شدند. در پایان آزمایش، نمونه‌های مدفوع در دمای اتاق ذوب شدند، به ازای هر گاو بر اساس وزن مساوی (FM) جمع‌آوری شدند، سپس به مدت تقریبی 96 ساعت در دستگاه سابلیماتور زیربوس 3-4-5/20 (فناوری زیربوس بنلوکس B. V.، تیل، هلند) منجمد و خشک شد و با استفاده از آسیاب Retsch  ZM200 (رچ بنلوکس، آرتسلار، بلژیک) پودر شدند و توسط یک الک 2 میلی‌متری غربال شدند. محتوای رطوبت، CP  (N × 6.25)، NDF، نشاسته، P، Ca، PP و TiO₂ با استفاده از روش‌های بالا تجزیه و تحلیل شد.

خون

نمونه‌های خون از هر گاو از ورید دنبالچه در روز چهارم دورۀ جمع‌آوری در حدود ساعت 12 بعد از ظهر گرفته شد. این زمان از روز به عنوان زمانی بین زمان‌های تهیۀ علوفۀ تازه و کنسانتره انتخاب شد. بنابراین، گاوها در ساعات قبل از نمونه‌برداری هر دو بخش خوراک را مصرف می‌کردند. نمونه‌ها برای کل P، بدون مرحلۀ تخریب، طبق روش
ISO 6491 (ISO، 1998) تجزیه و تحلیل شدند. C-تلوپپتید متقاطع سرم کلاژن نوع I (CTX)، نشانگر تشکیل استخوان، بر اساس روش CTX-I ELISA (IDS Plc، Tyne & Wear، انگلستان).

وزن بدن (BW) و نمرۀ وضعیت بدن (BCS)

BW فردی و BCS دو بار در روز به طور مستقیم پس از هر دوشش ثبت شدند.  BW از طریق مقیاس توزین خودکار و BCS با استفاده از سیستم BCS خودکار (دی‌لاول، کانزاس سیتی، MO) ثبت شدند. وضعیت بدن بر اساس روش مقیاس 1 تا 5 ادمونسون و همکاران (1989) نمره‌گذاری شد که در آن 1 = بسیار لاغر و 5 = چاق.

اندازه نمونه، محاسبات و تجزیه و تحلیل آماری

اندازه نمونه بر اساس یک آزمون دوطرفه با سطح اطمینان 95 درصد و توان 0.80 برای تشخیص تفاوت آماری معنی دار در قابلیت هضم ظاهری فسفر در کل دستگاه گوارش در تیمارهای دریفت کننده آنزیم فیتاز در مقایسه با جیرۀ شاهد محاسبه شد. اندازۀ اثر مورد انتظار بر اساس داده‌های منتشرشده در رابطه با واریانس قابلیت هضم فسفر در گاوهای شیرده بود (والک و همکاران، 2002؛ وو و همکاران، 2003؛ کینکید و همکاران، 2005؛ نولتون و همکاران، 2007). ترکیب شیمیایی کل جیره‌ها بر اساس ترکیب شیمیایی و مصرف علوفه و کنسانتره محاسبه شد. میزان دفع مدفوع DM برای هر گاو از تجویز روزانه TiO₂ (گرم در حیوان) تقسیم بر غلظت TiO2 (g/kg DM) در مدفوع محاسبه شد. برای این منظور، بازیابی مدفوعTiO₂  100درصد در نظر گرفته شد (گلیندمن و همکاران، 2009). دفع مدفوع CP، نشاسته، NDF، P، Ca و PP به عنوان دفع مدفوع DM ضرب در غلظت مؤلفۀ شیمیایی مربوط در مدفوع محاسبه شد. قابلیت هضم ظاهری کل مجاری هاضمه DM، CP، نشاسته، NDF، P، Ca و PP به صورت ATTD (%) = [(مصرف – دفع مدفوع)/مصرف] محاسبه شد. در فرمول بالا، دریافت و دفع مدفوع هر مؤلفۀ شیمیایی بر حسب کیلوگرم در روز بر اساس DM بود. میزان FPCM (کیلوگرم در روز) بر اساس 4٪ چربی و 3.3٪ پروتئین محاسبه شد. راندمان تغذیه به صورت FPCM تقسیم بر DMI، هر دو بر حسب کیلوگرم، محاسبه شد. داده‌های مربوط به تعداد سلول‌های سوماتیک (SCC) برای به دست آوردن توزیع نرمال قبل از تجزیه و تحلیل آماری، تغییر شکل داده شد. تمام داده‌ها به ازای هر گاو و هر هفته برای تجزیه و تحلیل آماری میانگین‌گیری شدند.

تمام تجزیه و تحلیل‌های آماری با استفاده از Genstat ویرایش 18ام (VSN  بین‌الملل، همل همپستد، انگلستان) انجام شد. داده‌ها با استفاده از ANOVA برای شناسایی اثرات تیمار تجزیه و تحلیل شد. میانگین‌های تیمار با استفاده از آزمون Tukey مقایسه شدند. داده‌ها به عنوان میانگین حداقل مربعات و مقادیر SEM ادغام‌شدۀ مرتبط ارائه می‌شوند. تجزیه و تحلیل‌های آماری برای همۀ متغیرها (به جز P در شیر و خون و ATTD) با استفاده از داده‌های پیش‌دوره به عنوان متغیر کمکی و با استفاده از مدل زیر انجام شدند:

Y_ijk = μ + Block_i + Cov_j + T_rtk + ­ Ԑ_ijk

که در آن Y_ijk متغیر پاسخ است، μ میانگین کلی است، Block_i اثر بلوک است (i = 1-10)، Cov_j  کوواریانس ناشی از دوره پیش‌ آزمایش، T_rtk اثر تیمار تغذیه‌ای است (k = 1-3) و ε_ijk خطای باقیمانده است.

برای تجزیه و تحلیل آماری محتوای فسفر در شیر و خون و قابلیت هضم ظاهری کل مجاری هاضمه، از همان مدل استفاده شد، با این تفاوت که پیش‌دوره به عنوان متغیر کمکی در نظر گرفته نشد. علاوه بر این، اثر سطح دوز فیتاز بر قابلیت هضم ظاهری کل مجاری هاضمه مصرف مواد مغذی و دفع مدفوع مواد مغذی در طول دورۀ جمع‌آوری مدفوع با کنتاستره‌های چندجمله‌ای برای تعیین پاسخ خطی و درجه دوم به افزایش دوز فیتاز، با در نظر گرفتن توزیع نابرابر بین سطوح دوز فیتاز، تجزیه و تحلیل شد. معنی‌داری آماری در P <0.05 اعلام شد. 0.05 ≤ P < 0.1 یک روند در نظر گرفته شد.

نتایج

ترکیب شیمیایی جیره‌ها

به طور کلی، ترکیب شیمیایی کنسانتره (جدول 2) و خوراک کامل (جدول 3) در بین تیمارها مشابه بود. برای کل جیره‌ها، اگرچه محتوای فسفر اندکی کمتر از مقدار مدنظر (2.8 گرم بر کیلوگرم DM) بود، محتوای آن در میان تیمارها مشابه بود (2.6 گرم / کیلوگرم DM برای همۀ تیمارها). سطح PP کل جیره‌ها نیز اندکی کمتر از مقدار فرموله‌شده بود (0.2- گرم بر کیلوگرم DM)، اما مجدداً مقدار آن در میان تیمارها مشابه بود (0.6 تا 0.7 گرم بر کیلوگرم DM). فعالیت فیتاز در کنسانتره جیره شاهد کم بود (431 FTU/kg، بر اساس DM؛ جدول 2). پس از کسر فعالیت فیتاز جیره شاهد از کل فعالیت آنزیمی در کنسانتره، فعالیت فیتاز اگزوژن در تیمارهای 2000 PhyG  و 5000PhyG ، به ترتیب 1813 و 6403 FTU/kg DM تعیین شد (جدول 3).

مصرف خوراک، تولید و ترکیب شیر و آزمایش های خونی

جدول 4 اثر مکمل PhyG را بر مصرف مادۀ خشک (DMI)، وزن بدن، بازدهی خوراک- که به صورت DMI/FPCM بیان گردید-، تولید شیر و ترکیب شیر در طول دورۀ آزمایشی، و تجزیه نمونه های خون در روز 18 آزمایش را نشان می‌دهد. در این دوره، اثر تیمار بر تولید شیر یا FPCM که میانگین آن‌ها به ترتیب 33.5 و 35.9 کیلوگرم در روز بود، هیچ تأثیری نداشت. به طور مشابه، محتوای چربی و لاکتوز تحت تأثیر تیمار قرار نگرفت. محتوای پروتئین شیر تحت تأثیر تیمار تغذیه‌ای قرار گرفت
(0.08P = ). گاوهایی که با تیمار 5000PhyG  تغذیه ‌شدند، نسبت به گاوهایی که با جیره شاهد تغذیه ‌شدند، محتوای پروتئین شیر بالاتری داشتند (به ترتیب 3.72٪ در مقابل 3.68٪). محتوای فسفر شیر و خون، و متابولیسم استخوان، که به صورت CTX در جدول 4 نشان داده شد، تحت تأثیر تیمار قرار نگرفت. همچنین تیمار در طول دورۀ آزمایشی بر DMI، BW، BCS، یا بازده تغذیه هیچ اثری نداشت.

مصرف مواد مغذی، دفع و قابلیت هضم ظاهری در کل دستگاه گوارش

تأثیر تیمار بر مصرف مادۀ خشک (DMI) و دریافت مواد مغذی، قابلیت هضم ظاهری کل مجاری هاضمه و دفع مدفوع در طول دورۀ جمع‌آوری مدفوع 5 روزه (روزهای 15ام تا 19ام) در جدول 5 ارایه شده است. در طول این دوره، هیچ تاثیری از تیمار بر DMI، مصرف CP، نشاسته، NDF، فسفر کل یا کلسیم مشاهده نشد. با وجود این، مصرف PP (0.06 = P) در تیمار 5000Phy  (16.5 گرم در روز) کمتر از گروه شاهد (18.7 گرم در روز)، هرچند با 2000Phy  (17.0 گرم در روز) مشابه بود.

اثر تیمار بر دفع پروتئین خام (0.01P =)، فسفر کل (0.02= P)،  PP (0.001P <) و کلسیم (0.04P =) معنی دار بود. دفع پروتئین، فسفر کل و PP از مدفوع گاوهای دریافت کننده 2000PhyG  و 5000PhyG  کمتر از گروه شاهد بود (به ترتیب 10.3٪، 13.1٪ و 65.9٪ کاهش در 5000PhyG  نسبت به شاهد). دفع مدفوعی فسفر کل به صورت خطی کاهش یافت (0.01 = P)، در حالی که دفع PP به صورت خطی و درجه دوم متناسب با افزایش سطح PhyG  (0.05P <) بود. دفع پروتئین به صورت خطی کاهش یافت (0.08= P). دفع کلسیم در 5000PhyG  کاهش یافت (11.4٪)، اما بین 2000PhyG  و گروه شاهد تفاوتی نشان نداد. کاهش دفع کلسیم روندی خطی متناسب با افزایش سطح PhyG (0.06 = P) داشت. تیمار تغذیه‌ای بر دفع ماده خشک (0.06P =) و NDF (0.08P =) تاثیر داشتند ولی اثر وابسته به مقدار به شکل خطی یا درجه دوم مشاهده نشد.

قابلیت هضم ظاهری پروتئین، فسفر کل و PP تحت تأثیر تیمار قرار گرفت
(0.01 > P). همچنین، اثر تیمار بر قابلیت هضم ظاهری DM (0.06P =) و کلسیم
(0.05 = P) تأثیر گذار بود. قابلیت هضم ظاهری پروتئین برای گاوهای تغذیه‌شده با 2000 PhyG  و 5000PhyG  بیشتر از گاوهای تغذیه‌شده با جیره شاهد بود (به ترتیب 2.7% و 3.8+% امتیاز؛ 0.06P <)، در حالی که قابلیت هضم ظاهری P در گاوهای تغذیه‌شده با 5000 PhyG بیشتر از گاوهای گروه شاهد بود (7.8٪ امتیاز؛ 0.05P <). قابلیت هضم ظاهری در کل دستگاه گوارش برای  Caدر گاوهای تغذیه‌شده با 5000PhyG  بیشتر از گروه شاهد (با 9.2٪ امتیاز) بود. رابطه خطی مثبتی بین سطح PhyG و قابلیت هضم ظاهری DM، CP، P، Ca و PP وجود داشت (05/0 > P). افزایش قابلیت هضم ظاهری PP در سطوح آنزیم بین 0 تا 5000 FTU/kg 6/4 درصد بود.

جدول 4. اثر مکمل فیتاز بر وزن بدن، مادۀ خشک مصرفی، بازده تغذیه، تولید و ترکیب شیر (در طول دورۀ آزمایشی 19روزه) و بر تجزیه و تحلیل خون (اندازه‌گیری‌شده در روز 18ام)

¹CON، کنترل؛ 2000 PhyG ، حاوی فیتاز PhyG در جیرۀ 2000FTU/kg  DM ، 5000PhyG  حاوی فیتاز PhyG در جیرۀ 5000 FTU/kg DM.

² تولید شیر غنی‌شده با چربی و پروتئین (FPCM).

³ به عنوان FPCM/DMI، هر دو بر حسب کیلوگرم، محاسبه می‌شود.

⁴ CTX، C-تلوپپتید عرضی سرم در کلاژن نوع I.

بحث

برای تعیین اینکه آیا فیتاز اگزوژن قابلیت هضم فسفر را بهبود می‌بخشد یا خیر، لازم است حیوانات با مقدار فسفر کمتر از نیاز تغذیه شوند. در آزمایش حاضر، برای دستیابی به این هدف، کل جیره‌ها به گونه‌ای فرموله شدند که محتوای فسفر کم (بدون Pi در کنسانتره) باشند که تقریباً 90 درصد از کل نیاز فسفر را مطابق دستورالعمل هلندی تامین کنند (COMV، 2005). در تمام تیمارها، کل جیره‌ها حاوی فسفر در 2.6 گرم بر کیلوگرم مادۀ خشک بود. سطوح فیتاز استفاده‌شده (2000 و 5000 FTU/kg مادۀ خشک) بر اساس سطوح سایر 6-فیتازهای میکروبی اگزوژن که در مطالعات بهبود قابلیت هضم فسفر در گاوهای شیرده گزارش شده‌اند (براسک-پدرسن و همکاران، 2013؛ وینتر و همکاران 2015) و با در نظر گرفتن امکان اقتصادی گنجاندن فیتاز PhyG در جیرۀ غذایی گاوهای شیرده انتخاب شدند. تجزیه و تحلیل جیره‌ها نشان داد سطح فعالیت فیتاز در جیره‌های 2000PhyG  و 5000 PhyG  به طور کلی با مقدار هدف گذاری شده، پس از کسر فعالیت جیره شاهد مطابقت دارد. فعالیت تحلیل‌شده فیتاز در جیره شاهد از طریق حضور فیتاز ذاتی در ترکیبات غلات کنسانتره تأمین شده است، همان‌طور که در سایر مطالعات فیتاز مشاهده شده است (درسیانت لی و همکاران، 2020a؛ ولیودان و همکاران، 2021). گاوها DMI مشابهی را در بین تیمارها نشان دادند (هم در دورۀ جمع‌آوری مدفوع 5روزه و هم در کل دورۀ آزمایشی 19روزه)، و از آنجایی که ترکیب شیمیایی بین جیره‌ها مشابه بود، مصرف تمام مؤلفه‌های شیمیایی در بین تیمارها نیز مشابه بود، به جز PP. مصرف PP با 5000PhyG  ، 12درصد کمتر از مصرف آن با جیره شاهد بود. به نظر می‌رسد این امر از ترکیب محتوای PP کمتر کنسانتره در 5000PhyG  نسبت به جیره شاهد (به ترتیب 2.33 در مقابل 2.00 گرم بر کیلوگرم، با همان رژیم غذایی پایه)، همراه با نسبت کمتر مصرف کنسانتره به علوفه نتیجه شده باشد (30:70 در 5000PhyG ، 32:68 در جیره شاهد بر اساس DM، در مقایسه با نسبت 35:65). به لحاظ نظری، کاهش مصرف PP ممکن است به تفاوت‌های مشاهده‌شده در قابلیت هضم و دفع مواد مغذی در تیمار 5000PhyG  در مقایسه با گروه شاهد کمک کند. با وجود این، کاهش دفع PP در این جیره بسیار بیشتر از کاهش مصرف PP بود (کاهش دفع PP  در 5000 PhyG  %66 بیشتر از کاهش دفع آن در جیره شاهد بود) که نشان می‌دهد افزایش قابلیت هضم مواد مغذی و کاهش دفع مواد مغذی در 5000PhyG  به دلیل فعالیت فیتاز اضافه‌شده بود و نه تفاوت در مصرف PP.

در داخل بدن، فیتاز میکروبی اگزوژن هیدرولیز فیتات (IP6) را با انجام دی فسفوریلاسیون گام به گام فیتات (IP6 که حاوی یک حلقه اینوزیتول با شش گروه فسفات متصل است)، به استرهای اینوزیتول با فسفات پایین‌تر(IP5، IP4، IP3، IP2 و IP1) به پیش می برد؛ در هر مرحله یک گروه فسفات آزاد می‌شود که ممکن است جذب شود و توسط حیوان برای نگهداری و رشد استفاده شود (شلمر و همکاران، 2001؛ گرینر و کونییتزنی، 2011). مطالعات در حیوانات تک‌معده‌ای نشان داده شده است که هیدرولیز فیتات توسط فیتاز میکروبی به طور مداوم و مستقیم دسترسی و قابلیت هضم فسفر را بهبود می‌بخشد (تورس-پیتارک و همکاران  2017، 2019؛ درسیانت لی و همکاران، 2020b)، اما ممکن است به طور غیرمستقیم دسترسی و قابلیت هضم سایر مواد مغذی مرتبط با فیتات، مانند سایر مواد معدنی علاوه بر فسفر، پروتئین‌ها و اسیدهای آمینه، را نیز بهبود بخشد (که به اصطلاح اثرات « فرا فسفری» فیتاز نامیده می‌شود) (درسیانت لی و همکاران، 2015). در مطالعۀ حاضر، در گاوهایی که با رژیم غذایی 5000 PhyG تغذیه شدند، قابلیت هضم ظاهری پروتئین در کل دستگاه گوارش به طور چشمگیر افزایش یافت. این افزایش در سطح فیتاز (2000 FTU/kg DM) تقریباً 3 درصد بود. در حالی که مقایسۀ میانگین‌ها نشان نمی‌دهد ATTD  با دوز بالاتر فیتاز (5000 FTU/kg DM) افزایش می‌یابد، تضادهای چندجمله‌ای رابطۀ دوز-پاسخ را که ماهیت آن خطی است، نه درجه دوم، تأیید می‌کنند. با مقدار فیتاز در 5000 FTU/kg  DM، قابلیت هضم ظاهری پروتئین 4 درصد بیشتر از گاوهای گروه شاهد بود.

در حیوانات تک‌معده‌ای (طیور و خوک)، 6-فیتازهای باکتریایی از جمله PhyG هضم اسیدهای آمنه و پروتئین و همچنین مصرف پروتئین را به روشی وابسته به مقدار بهبود می‌بخشند (امره و همکاران، 2014؛ آدوکون و همکاران، 2015؛ درسیانت لی و همکاران، 2020a،  2020b). در مطالعۀ مدل‌سازی که داده‌های چهار مطالعه جداگانه را تجزیه و تحلیل کرد، میانگین بهبود قابلیت هضم اسیدهای آمینه در روده توسط PhyG با دوز 2000 FTU/kg در جوجه‌های گوشتی، 4.3 درصد بیشتر از گروه شاهد منفی برآورد شد (درسیانت لی و همکاران، 2020b). چند ساز و کار برای اثر مثبت فیتاز اگزوژن بر قابلیت هضم پروتئین و اسیدهای آمینه در حیوانات تک‌معده‌ای پیشنهاد شده است. این مکانیسم‌ها عبارت‌اند از: کاهش فراوانی کمپلکس‌های دوتایی (پروتئین-فیتات) و سه‌تایی (پروتئین-کلسیم-فیتات) در دستگاه گوارش دیستال (GIT) به دلیل هیدرولیز PP توسط فیتاز در GIT پروگزیمال؛ کاهش جریان اسیدهای آمینه درون‌زا در نتیجۀ تجزیۀ فیتات جیرۀ غذایی که در غیر این صورت تلفات درون‌زا اسیدهای آمینه را افزایش می‌دهد (کاویسون و همکاران، 2004) و افزایش جذب اسیدهای آمینه در روده (لیو و همکاران، 2008؛ سل و همکاران، 2012). نحوۀ عملکرد فیتاز در بهبود قابلیت هضم AA و/یا CP در گاوهای شیرده مشخص نیست. ممکن است تصور شود فیتاز به دلیل کاهش اثر ضد تغذیه‌ای فیتات در مسیر فرعی شکمبه ، قابلیت هضم CP بهبود یابد. در مطالعۀ حاضر، افزایش قابلیت هضم ظاهری CP با کاهش محتوای CP در مدفوع همراه بود (به میزان 0.14 کیلوگرم در روز با دوز PhyG 5000 FTU/kg  DM در مقابل جیره شاهد) که نشان‌دهندۀ بازدهی استفاده بهتر پروتئین غذاها است. این سطح کاهش در دفع CP از دیدگاه زیست‌محیطی توجه تولیدکنندگان را به خود جلب می‌کند، زیرا قوانین مربوط به دفع نیتروژن ناشی از تولید گاوهای شیرده در مزرعه به طرزی فزاینده‌ در کشورهای مختلف وضع و تنظیم شده است. در تیمار با بالاترین مقدار فیتاز در مقایسه با گروه شاهد، محتوای پروتئین شیر بیشتر بود، که با افزایش قابلیت هضم CP مطابقت دارد و نشان می‌دهد به دلیل فعالیت فیتاز، در جیرۀ غذایی 5000PhyG  پروتئین بیشتر در دسترس بوده است.

بر اساس دانش نویسندگان مقاله، در مطالعات قبلی اثر فیتاز اگزوژن بر محتوای پروتئین شیر در گاوهای شیرده مشاهده نشده است. فرض بر این است که قابلیت هضم بیشتر CP منجر به افزایش جذب اسیدهای آمینه می‌شود و این امر در دسترس بودن اسیدهای آمینه برای سنتز پروتئین شیر را افزایش می‌دهد؛ مشخص شده است که سنتز پروتئین شیر به‌شدت به در دسترس بودن اسیدهای آمینه، به ویژه متیونین، لیزین و هیستیدین بستگی دارد (کیم و لی، 2021). برای ارزیابی اثر فیتاز اگزوژن بر محتوای پروتئین شیر در گاوهای شیرده به مطالعات بیشتری نیاز است.

این آزمایش همچنین اثر واضح مکمل فیتاز را بر قابلیت هضم ظاهری P و PP در کل دستگاه گوارش نشان می دهد. قابلیت هضم ظاهری  PPدر تیمار شاهد (93%) به طرزی چشمگیر کمتر از مقدار مشاهده‌شده (98٪) در مطالعۀ اولیه توسط کلارک و همکاران (1986) بود و به 90٪ تجزیه‌پذیری PP در کل مجاری هاضمه که توسط براسک-پدرسن و همکاران (2013) گزارش شده بود، نزدیک‌تر بود. این یافته‌ها مهر تأییدی بر این فرضیه است که برخلاف تصورات گذشته، PP غذاها ممکن است به طور کامل توسط گاوهای شیرده مصرف نشوند. این موضوع به ویژه برای مواد غذایی غنی از فیتات و مواد محافظت‌شده در شکمبه صادق است. در چنین جیره‌هایی است که فیتاز اگزوژن می‌تواند بیشترین فایده را داشته باشد. در مطالعۀ حاضر، افزایش قابلیت هضم ظاهری کل مجاری هاضمه  PP (بیشتر از جیرۀ کنترل) به میزان 2.5% و 4.6% با دوز PhyG به ترتیب 1813 و 6403 FTU/kg  DM (بر اساس اندازه گیری فعالیت آنزیم) در گاوها مشاهده شد. جارت و همکاران (2014) افزایش عددی در قابلیت هضم ظاهری PP از 96.7٪ به 97.6٪ را در جیره‌های با 1500FTU/kg  DM مکمل از یک فیتاز ناشناس گزارش کردند. از سوی دیگر، کینکید و همکاران. (2005) افزایش قابلیت هضم ظاهری کل مجاری هاضمه PP را از 80% به 85% با 427 FTU/kg DM آسپرژیلوس نیجر فیتاز مشاهده کردند، در حالی که جیاگنونی و همکاران (2021) افزایش 1.4 درصدی در افزایش قابلیت هضم ظاهری PP را با 6000 FTU/kg  DM هیستیدین اسید فسفاتاز بیان‌شده در آسپرژیلوس اوریزا گزارش کردند (ضریب هضم 0.981 با فیتاز در مقابل 0.967 بدون فیتاز). واضح است که مرحلۀ فیزیولوژیکی گاوهای شیرده، ترکیب جیرۀ غذایی، سطح قابلیت هضم PP پایه و منبع فیتاز همگی ممکن است بر اثر فیتاز برون‌زا بر قابلیت هضم ظاهری کل مجاری هاضمه PP تأثیر بگذارند.

جدول 5. اثر مکمل فیتاز بر مصرف مواد مغذی، دفع مدفوع، و قابلیت هضم ظاهری کل مجاری هاضمه (ATTD) در طول دورۀ جمع‌آوری مدفوع 5روزه

¹CON، کنترل؛ 2000PhyG ، حاوی فیتاز PhyG در جیرۀ 2000FTU/kg  DM ، 5000PhyG  حاوی فیتاز PhyG در جیرۀ 5000 FTU/kg DM.

^a,b,c میانگین‌هایی که دارای حروف کوچک بالانویس مختلف در یک ردیف هستند، در 0.05P < به طور جالب توجهی متفاوت هستند.

قابلیت هضم فسفر در کل دستگاه گوارش با افزایش مقدار فیتاز به صورت خطی افزایش یافت، به طوری که در سطح 5000FTU/kg  DM در مقایسه با جیره شاهد، %8 بهبود نشان داد. این مقدار بهبود در قابلیت هضم ظاهری فسفر فراتر از آنچه در مطالعات قبلی گزارش شده است، می باشد. در واقع، وینتر و همکاران (2015) هیچ اثری از سیتروباکتر براکی فیتاز بر قابلیت هضم ظاهری فسفر در جیره‌های با محتوای فسفر کم (2.6 گرم بر کیلوگرم DM، برابر با مقداری که در مطالعۀ حاضر گزارش شده است) مشاهده نکردند. در مقابل، کینکید و همکاران (2005) افزایش قابلیت هضم ظاهری فسفر در کل دستگاه گوارش را در جیره مکمل شده با A. نیجر فیتاز (5.4 درصد و 3.7 درصد بیشتر از جیرۀ حاوی مقدار کافی P ، به ترتیب در جیره‌های حاوی گندم سیاه و جو بخارپز) مشاهده کردند (07/0 = P). جالب توجه است در جیره‌های غذایی حاوی 3.2 تا 3.4 گرم  DM P/kg [یعنی بیشتر از 2.6 گرم بر کیلوگرم DM در مطالعۀ حاضر و بیشتر از نیاز فسفر توصیه‌شدۀ هلندی برای گاوهای شیرده که با مصرف 3.3 گرمP/kg  DM، 40 کیلوگرم شیر در روز تولید می‌کنند (COMV، 2005[، جیاگنونی و همکاران (2021) برهم‌کنش (06/0 = P) بین مرحلۀ شیردهی (اوایل در مقابل اواسط) و مکمل فیتاز (حضور در مقابل عدم حضور) را مشاهده کردند. نویسندگان مشاهده کردند قابلیت هضم ظاهری P در مقایسه با جیره‌ شاهد، با افزودن فیتاز در اوایل شیردهی افزایش یافت، اما در اواسط شیردهی تغییر نکرد. با این حال، قابلیت هضم ظاهری PP صرف‌نظر از مرحلۀ شیردهی بهبود یافت. در مطالعۀ حاضر، گاوها در اواسط شیردهی بودند، بنابراین افزایش قابلیت هضم ظاهری P توسط فیتاز در تضاد با یافته‌های جیاگنونی و همکاران (2021) است. نتایج متفاوت ممکن است به محتوای متفاوت فسفر در جیره‌های استفاده‌شده در این دو مطالعه باشد. افزایش وابسته به مقدار در قابلیت هضم ظاهری PP و P با کاهش وابسته به مقدار دفع PP و P از راه مدفوع در تیمارهای حاوی فیتاز (در مقایسه با جیره شاهد) مشاهده شد. کاهش 4.9 گرم در روز در دفع فسفر با PhyG در 5000 FTU/kg  DM می‌تواند به روشی مشابه آنچه برای نیتروژن در بالا بیان شد، به کاهش آلودگی ناشی از فسفر در مزارع کمک کند.

به نظر می‌رسد روش تهیۀ خوراک ممکن است بر تاثیر مشاهده‌شدۀ فیتاز برون‌زا بر مصرف و قابلیت هضم PP تأثیر بگذارد. در بیشتر متون مربوط به گاوهای شیرده، جیره‌ها به‌ عنوان جیرۀ کاملاً مخلوط ارائه شده‌اند که این امر ممکن است به دلیل تماس مستقیم با رطوبت که عمدتاً ناشی از بخش علوفۀ جیرۀ کاملاً مخلوط است، فیتاز اضافه‌شده در جیره را قبل از مصرف فعال کند. این موضوع توسط براسک-پدرسن و همکاران (2013) گزارش شده است. در مطالعۀ حاضر، فیتاز در داخل کنسانتره، جدا از علوفه تهیه شد. میزان رطوبت کنسانترۀ پلت‌شده کم بود (به طور متوسط 99 گرم بر کیلوگرم). بنابراین، احتمال فعال‌سازی فیتاز کمتر بود، اما این احتمال را نباید کاملاً منتفی دانست. در واقع، محتوای PP تعیین ‌شده در کنسانتره‌ها در تیمارهای حاوی فیتاز کمی کمتر از کنسانتره‌های گروه شاهد بود. اینکه آیا فیتاز در کنسانتره‌ها فعال شده است یا خیر و در صورت فعال شدن، به چه میزان، بی‌پاسخ مانده است و  لازم است در مطالعات آتی به آن توجه شود.

محتوای فسفر غیرآلی خون، هنگامی که در کنار سایر شاخص‌ها استفاده می‌شود، ممکن است نشانه‌ای از وضعیت تغذیه‌ای فسفر در گاوهای شیرده باشد (فورار و همکاران، 1982). مشخص شده است که میزان فسفر خون تحت تأثیر مصرف فسفر در جیرۀ غذایی قرار می‌گیرد (رید و همکاران، 1986). بنابراین، در صورتی که میزان جذب فسفر در رودۀ کوچک افزایش یافته باشد، انتظار می‌رود قابلیت هضم بیشتر فسفر در جیره‌های غذایی با محتوای فسفر کم به افزایش فسفر در خون یا استخوان منجر شود. در مطالعۀ حاضر، هیچ اثری از فیتاز بر روی P یا CTX خون (نشانگر تشکیل استخوان) مشاهده نشد. با این حال، این لزوماً به معنای عدم وجود اثر نیست. کنسانتره‌ها سه بار در روز (تقریباً در ساعت‌های 05:00، 12:30 و 18:30) عرضه می‌شدند، در حالی که نمونه‌های خون در ساعت 12:00 گرفته می‌شدند. بنابراین، نمونه‌های خون 7 ساعت پس از اولین تغذیه گرفته می‌شدند که تا آن زمان این احتمال وجود داشت که فسفر جذب‌شده در خون به بافت‌ها منتقل شده باشد. علاوه بر این، در حالی که هیچ اثر آماری معنی‌داری وجود نداشت، مشخص شد P خون از نظر عددی افزایش یافته است و CTX خون از نظر عددی کاهش یافته است که ممکن است حاکی از بهبود در دسترس بودن فسفر در تیمارهای حاوی فیتاز در مقایسه با گروه کنترل باشد. در مطالعۀ حاضر، درصد فسفر در شیر نیز تحت تأثیر افزودن فیتاز قرار نگرفت که ممکن است با ماهیت کوتاه‌مدت مطالعه مرتبط باشد. با وجود این، مشخص است که مصرف فسفر تأثیر زیادی بر محتوای فسفر شیر ندارد (فورار و همکاران، 1982) و محتوای فسفر شیر بیشتر به محتوای پروتئین شیر مربوط می‌شود (شیر حاوی فسفر متصل به پروتئین است). به نظر می‌رسد در مطالعۀ حاضر، افزایش پروتئین شیر در گاوهای تغذیه‌شده با جیره‌های حاوی فیتاز برای تأثیرگذاری بر محتوای فسفر شیر کافی نبود. به طور مشابه، مطالعۀ کینکید و همکاران (2005) هیچ اثری از فیتاز اگزوژن بر محتوای فسفر شیر را نشان نداد.

در این مطالعه، مقدار فیتاز در سطح بالاتر (5000 FTU/kg DM) قابلیت هضم ظاهری کلسیم را در کل دستگاه گوارش بهبود داد (05/0 = P). در حیوانات تک‌معده‌ای، اثر مثبت فیتاز بر قابلیت هضم کلسیم به کاهش تشکیل کمپلکس‌های کلسیم-فیتات در دستگاه گوارش دیستال در نتیجۀ تجزیۀ فیتات نسبت داده شده است. در غیر این صورت، این کمپلکس‌ها رسوب می‌کنند و به‌آسانی در pH بیشتر از 5.0 هضم نمی‌شوند (در رودۀ کوچک که در آن کلسیم جذب می‌شود)، در نتیجه دسترسی کلسیم آزاد برای جذب و مصرف را کاهش می‌دهند (سل و همکاران، 2009). از آنجایی که نواحی خاص روده برای فعالیت PhyG در دستگاه گوارش دیستال گاوهای شیرده هنوز مشخص نشده‌اند، مشخص نیست که آیا به‌کارگیری روش مشابه در گاوهایی که با 5000PhyG  تغذیه می‌شوند می‌تواند به افزایش قابلیت هضم کلسیم منجر شود، یا آیا این افزایش با بهبود قابلیت هضم فسفر و در نتیجه تعادل بهتر کلسیم و فسفر در محل‌های جذب که به جذب بیشتر کلسیم منجر می‌شود، مرتبط است. در این زمینه به انجام پژوهش‌های بیشتر نیاز است.

در حال حاضر، اطلاعات کمی در رابطه با مکان(های) فعالیت فیتاز میکروبی اگزوژن در دستگاه گوارش گاو وجود دارد. مطالعۀ براسک-پدرسن و همکاران (2013) غلظت IP₆ و استرهای IP پایین‌تر در مایع عضمی شکمبه، دوازدهه، ایلئوم و مدفوع را اندازه‌گیری کرد و گزارش داد که تجزیۀ فیتات (IP₆) به طور عمده (اگرچه نه منحصراً) قبل از دوازدهه اتفاق افتاده است. پژوهشگران همچنین افزایش وابسته به دوز را در تجزیۀ IP₆ در شکمبه در تیمارهای حاوی فیتاز اگزوژن (تا حداکثر 9.9 درصد امتیاز با افزودن فیتاز با دوز 6367 FTU/kg DM) گزارش کردند که نشان‌دهندۀ فعالیت فیتاز در شکمبه است. با وجود این، به دلیل فعالیت جالب توجه قبل از مصرف (اندازه‌گیری‌شده) فیتاز، نویسندگان نتوانستند بین تجزیۀ فیتات در شکمبه و جیرۀ کاملاً مخلوط تمایز قائل شوند. برای تعیین مکان فعالیت فیتاز PhyG در تجزیۀ فیتات در گاوهای شیرده، لازم است بررسی‌های بیشتر انجام شود. آنچه از نتایج حاضر مشخص است این است که فیتاز، در هر جایی که فعال بود، به افزایش وابسته به دوز در قابلیت هضم ظاهری کل مجاری هاضمه PP در مقایسه با جیرۀ غذایی کنترل بدون مکمل، منجر شد.

نتیجه‌گیری

قابلیت هضم ظاهری CP، P، PP و Ca در کل دستگاه گوارش با مکمل‌های 6-فیتاز باکتریایی بیوسنتزی در جیره‌های کم فسفر به شیوه‌ای خطی وابسته به مقدار بهبود یافت. بهبودهای مشاهده شده در قابلیت هضم در گروه های دریافت کننده فیتاز نسبت به گروه شاهد معنی دار بود. همچنین قابلیت هضم ظاهری Ca در کل دستگاه گوارش در گروه 5000 FTU/kg بهبود معنی داری یافت. علاوه بر این، دفع P، PP و CP مدفوع در گروه های 2000 یا 5000 FTU/kg فیتاز کاهش یافت و محتوای پروتئین شیر در سطح 5000 FTU/kg افزایش پیدا کرد. این مطالعه به وضوح نشان داده است افزودن مکمل فیتاز جدید در سطح 2000 FTU/kg یا بالاتر به جیرۀ غذایی گاوهای شیرده، راهکاری برای کاهش دفع P و CP از طریق بهبود قابلیت هضم این مواد مغذی است. به این ترتیب، مکمل فیتاز رویکردی مهم برای بهینه‌سازی تعادل مواد مغذی و کاهش آلودگی محیطی فسفر و نیتروژن از مزارع دامداری ارائه می‌دهد. انجام پژوهش‌های بیشتر در شرایط طولانی‌مدت و با گاوهای اوایل دورۀ شیردهی توصیه می‌شود.